Juana fue la tercera de los hijos de Fernando II de Aragón y de Isabel I de Castilla. Nació en Toledo el 6 de noviembre de 1479​ y fue bautizada con el nombre del santo patrón de su familia, al igual que su hermano mayor, Juan. Fue infanta de Castilla y Aragón y desde pequeña, recibió la educación propia de una infanta e improbable heredera al trono, basada en la obediencia más que en el gobierno, a diferencia de la exposición pública y las enseñanzas del gobierno requeridas en la instrucción de un príncipe heredero. Su madre, la reina, que trató de moldearla a su «hechura devocional», aunque ya en 1495 Juana daba muestras de escepticismo religioso y poca devoción por el culto y los ritos cristianos, hecho que alarmaba a su madre, que ordenó que se mantuviese en secreto.

Como era costumbre en la Europa de esos siglos, Isabel y Fernando negociaron los matrimonios de todos sus hijos y con el fin de reforzar los lazos con el emperador Maximiliano I de Habsburgo ofrecieron a Juana en matrimonio a su hijo, Felipe, llamado El Hermoso, archiduque de Austria, duque de Borgoña y Brabante y conde de Flandes. En agosto de 1496, la futura archiduquesa partió de Laredo e inició su rumbo hacia Flandes, hogar de su futuro esposo.

La boda se celebró el 20 de octubre de 1496 en la iglesia colegiata de San Gumaro de la pequeña ciudad de Lier, siendo la ceremonia de la boda por el obispo de Cambray, Enrique de Bergen. Aunque los futuros esposos no se conocían, se enamoraron al verse. No obstante, Felipe pronto perdió el interés en la relación, lo cual hizo nacer en Juana unos celos que han sido considerados patológicos por varios autores.

Al poco tiempo llegaron los hijos, con periodos de abstinencia conyugal que agudizaron los celos de Juana. El 15 de noviembre de 1498, en la ciudad de Lovaina nació su primogénita, Leonor. El 24 de febrero de 1500 tuvo a su hijo Carlos, según se dice, en un retrete del palacio. Al año siguiente, el 18 de julio de 1501, en Bruselas, nació una hija, llamada Isabel, en honor de la madre de Juana, Isabel la Católica, a los que siguieron otros tres. Por muerte de sus hermanos Juan e Isabel y de su sobrino Miguel de la Paz, se convirtió en heredera de las coronas de Castilla y de Aragón, así como en señora de Vizcaya, título que ya entonces iba unido a la corona de Castilla y que Juana heredó de su madre Isabel.

En noviembre de 1501 Felipe y Juana, dejando a sus hijos en Flandes, emprendieron camino hacia Castilla por tierra desde Bruselas. Tardaron seis meses en llegar a Toledo,​ donde prestaron juramento como herederos ante las cortes castellanas en la catedral de Toledo el 22 de mayo de 1502.

En 1503 el marido de Juana, Felipe, regresó a Flandes a fin de resolver unos asuntos, mientras que Juana, embarazada, permanecía en España a petición de sus padres, quienes deseaban que ella conociera a sus futuros súbditos. Este alejamiento de su marido e hijos la sumió en una gran tristeza.​ El 10 de marzo de 1503, en la ciudad de Alcalá de Henares, dio a luz un hijo al que llamó Fernando. Tras el parto, y con sus tres hijos mayores en Bruselas, Juana volvió a pedir autorización para regresar a Flandes, pero su madre se opuso. La guerra con Francia convertía en inviable el camino por tierra. Ante la insistencia de Juana, Isabel ordenó al obispo Fonseca que recluyera a su hija en el castillo de la Mota. Madre e hija terminaron en disputa y, al final, Isabel consintió que Juana regresase a Flandes, donde llegó en junio de 1504.​

La reina Isabel murió el 26 de noviembre de 1504, planteándose el problema de la sucesión en Castilla. Su madre desheredó a Juana en su testamento porque no iba a misa ni quería confesarse.​ Sin embargo, su padre, Fernando, la proclamó reina de Castilla (de 1504 a 1555) y siguió él mismo gobernando el reino. El marido de Juana, el archiduque Felipe, no estaba dispuesto a renunciar al poder, y en la concordia de Salamanca (1505) se convino el gobierno conjunto de Felipe, Fernando el Católico y la propia Juana. Entretanto, Felipe y Juana permanecieron en la corte de Bruselas, donde el 15 de septiembre de 1505 ella dio a luz a su quinto hijo, una niña a la que llamaron María. A finales de 1505, Felipe estaba impaciente por llegar a Castilla y por ello partieron el 10 de enero de 1506, con 40 barcos.

En el canal de la Mancha, una fuerte tormenta hundió varios navíos y dispersó al resto. Se temió por la vida de los reyes, que tuvieron que permanecer durante tres meses en Inglaterra. En Londres, Juana pudo visitar durante un día a su hermana Catalina, a la que no veía desde hacía diez años. Zarparon de nuevo en el mes de abril de 1506 hacia La Coruña.

Felipe consiguió el apoyo de la mayoría de la nobleza castellana, por lo que Fernando tuvo que firmar la concordia de Villafáfila (27 de junio de 1506) y retirarse a Aragón, siendo Felipe proclamado rey de Castilla en las Cortes de Valladolid con el nombre de Felipe I.

El 25 de septiembre de ese año 1506 murió Felipe I el Hermoso en el Palacio de los Condestables de Castilla; según algunos, envenenado, y entonces circularon rumores sobre una supuesta locura de Juana. En ese momento, ella decidió trasladar el cuerpo de su esposo desde Burgos, donde había muerto y en el que ya había recibido sepultura, hasta Granada, viajando siempre de noche. Pero su padre se mostró reacio a permitir que su yerno estuviera enterrado en Granada antes que él mismo,​ y los desplazamientos se limitaron en un espacio reducido en Castilla.​ La reina Juana no se separaría ni un momento del féretro y este traslado se prolongaría durante ocho fríos meses por tierras castellanas. Ello hizo que las murmuraciones sobre la locura de la reina aumentasen cada día entre los habitantes de los pueblos que atravesaban.

El 24 de septiembre,​ la víspera de la muerte de Felipe I, los nobles acordaron formar un Consejo de Regencia interina para gobernar provisionalmente el reino​ presidido por Cisneros. ​ La nobleza contendió acerca de quién debía desempeñar la Regencia, pues, por un lado, estaban los que querían al emperador Maximiliano durante la minoría del príncipe Carlos, y, por otro lado, los que querían la regencia de Fernando el Católico tal y como quedó establecida en el testamento de Isabel la Católica y las cortes de Toro de 1505. Sin embargo, la reina Juana trató de gobernar por sí misma, revocó e invalidó las mercedes otorgadas por su marido, para lo cual intentó restaurar el Consejo Real de la época de su madre.

En la ciudad de Torquemada (Palencia), el 14 de enero de 1507, Juana daba a luz a su sexto hijo y póstumo de su marido, una niña bautizada con el nombre de Catalina. Tras regresar de tomar posesión del Reino de Nápoles, Fernando el Católico se entrevistó con su hija el 28 de agosto de 1507,​ y volvió a asumir el poder en Castilla como gobernador del reino.

En marzo de 1509, por orden de Fernando el Católico, fue recluida en un palacio del siglo XIV y que actualmente ya no existe. En este año Enrique VIII, se casó con la hija de Fernando, Catalina de Aragón, zanjando la oposición inglesa a la regencia de Fernando quien se aseguró un acuerdo favorable (que respetaba la voluntad de Isabel la Católica) en Blois en diciembre de este año, con Maximiliano I por el que el emperador renunciaba a sus pretensiones de regencia en Castilla, y en las Cortes de 1510 ratificaron a Fernando como regente. En 1515 Fernando incorporó a la Corona de Castilla el Reino de Navarra, que había conquistado tres años antes.

A la muerte de su padre en 1516, Juana pasó a ser nominalmente la reina de Navarra y soberana de la corona de Aragón (desde 1516 hasta 1555). Carlos se benefició de la coyuntura, de la incapacidad de su madre Juana para proclamarse reina, de forma que se apropió de los títulos reales que le correspondían a su madre. Así, oficialmente, ambos, Juana y Carlos, correinaron en Castilla y Aragón, pero, en la práctica, Juana no tuvo ningún poder real porque Carlos mantuvo a su madre encerrada. Juana I de Castilla, la que por derecho y sangre debía ser reina, fue confinada en Tordesillas y maltratada por su propio hijo, Carlos I de España y V del Sacro Imperio Romano Germánico.

 Desde que su padre la recluyera, en 1509, la reina Juana permaneció cuarenta y seis años en una casona-palacio-cárcel de Tordesillas, vestida siempre de negro y con la única compañía de su última hija, Catalina, hasta que esta salió en 1525 para casarse con Juan III de Portugal. 

Según algunos autores, Juana y su hija fueron ninguneadas y maltratadas física y psicológicamente por sus carceleros. Especialmente duros fueron los largos años de servicio de los segundos marqueses de Denia, Bernardo de Sandoval y Rojas y su esposa, Francisca Enríquez. A lo largo de aquellas largas décadas fue maltratada por los carceleros que la custodiaban y tal y como escribió su hija Catalina en una carta dirigida al rey en el mes de agosto de 1521, la encerraban en una cámara que no tenía luz alguna, «sino que se alumbra con velas, y no tiene otro sitio donde retirase más que la dicha cámara». El confinamiento de doña Juana, por su presunta incapacidad mental, era esencial para la legitimidad en el trono castellano, primero de su padre, Fernando, y después de su hijo, Carlos I.

Con motivo de la Guerra de las Comunidades de Castilla (1520), la figura de Juana la Loca volvió a cobrar importancia. Los jefes comuneros alzados en armas contra Carlos I intentaron ponerla de su parte: la Santa Junta de los comuneros reunida en Ávila proclamó que su único fin era el servicio de la reina Juana. Tras la toma de Tordesillas por parte del ejército de los comuneros el 29 de agosto de 1520, sus representantes fueron recibidos por la reina, pero ella se negó a intervenir en el conflicto en ningún sentido y a firmar ningún documento.

Después del incendio de Medina del Campo, muchas ciudades y villas se sumaron a la causa comunera, y los vecinos de Tordesillas asaltaron el palacio de la reina, obligando al marqués de Denia a aceptar que una comisión de los asaltantes hablara con doña Juana. Entonces se enteró la reina de la muerte de su padre y de los acontecimientos que se habían producido en Castilla. Días más tarde, Juan de Padilla se entrevistó con ella, explicándole que la Junta de Ávila se proponía acabar con los abusos cometidos por los flamencos y proteger a la reina de Castilla, devolviéndole el poder que le había sido arrebatado, si es que ella lo deseaba. Ante cualquier sospecha de que la reina estaba, en realidad, mentalmente estable, los adversarios del nuevo rey podrían derrocarlo por usurpador. De ahí que la figura de doña Juana se convirtiera en una pieza clave para legitimar el movimiento de las Comunidades.

En diciembre de 1520 el ejército realista recuperó Tordesillas. Cuando su hijo Carlos derrotó a los comuneros, volvió a encerrarla. Estuvo recluida durante 46 años con un breve periodo de libertad en 1533 por la peste que asolaba al reino. Los reyes Fernando y Carlos trataron de borrar cualquier vestigio documental del encierro de la reina Juana.

En los últimos años, a la presunta enfermedad mental, determinada según algunos por la infidelidad de su marido, hacia quien sentía un amor apasionad, se unía la física, completamente cierta. Tenía grandes dificultades en las piernas, las cuales finalmente se le paralizaron. Entonces volvió a ser objeto de discusión sugiriendo algunos religiosos que podía estar endemoniada. Por ello, su nieto, Felipe II, pidió a un jesuita, el futuro san Francisco de Borja, que la visitara y averiguara qué había de cierto en todo ello. Después de hablar con ella, el jesuita aseguró que las acusaciones carecían de fundamento y que, dado su estado mental, quizá la reina no había sido tratada adecuadamente. Su dictamen fue «que encontrándola muy mejorada, podía recibir la extremaunción, aunque no lo estaba para la comunión».

Juana I de Castilla falleció en Tordesillas el 12 de abril de 1555, asistida por San Francisco de Borja. Su cuerpo fue depositado en el convento de Santa Clara en Tordesillas; en 1573 sus restos fueron trasladados a la capilla real de la catedral de Granada. Sus últimas palabras fueron «Jesucristo crucificado sea conmigo».

Juana fue apodada «La Loca» por una supuesta enfermedad mental alegada por su padre y por su hijo para apartarla del trono y mantenerla encerrada en Tordesillas de por vida. Halló documentos en Simancas y en otros archivos que mostraban que la hasta entonces llamada Juana «la Loca» en realidad había sido víctima de una confabulación tramada por su padre, Fernando el Católico, y luego confirmada por su hijo, Carlos I.

Se ha escrito que la enfermedad podría haber sido causada por los celos hacia su marido y por el dolor que sintió tras su muerte. Esta visión de su figura fue popularizada en el Romanticismo, tanto en pintura como en literatura. En 1836, el pintor francés Charles de Steuben plasmó en un cuadro todos los tópicos de la leyenda sobre la reina y más tarde en España se dio rienda suelta a la imaginación y se fijó la imagen de la locura por amor de Juana. Pero, sin duda, la obra más famosa inspirada en la reina fue el cuadro Doña Juana «la Loca» (1877), de Francisco Pradilla y Ortiz, actualmente en el Museo del Prado. También en el cine se ha contemplado varias veces la figura de Juana La Loca, siendo la primera, la película de Juan de Orduña en el año 1948 interpretada por Aurora Bautista, Fernando Rey y Sara Montiel.

Jaime Mascaró